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技術(shù)文章

碘化丙啶的應(yīng)用和常見問題

碘化丙啶(Propidium iodide)是一個(gè)小分子芳香化合物,通常在研究和開發(fā)中作為熒光核酸結(jié)合染料。PI通常用于區(qū)分活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞,因?yàn)樗梢宰杂蓾B透死亡或損傷細(xì)胞膜,而不能進(jìn)入正?;罴?xì)胞。碘化丙啶能染色核酸,如DNARNA,因此可用作流式細(xì)胞儀、原位雜交和**組織化學(xué)應(yīng)用中細(xì)胞膜完整性的指示劑。

 

在樣品中加入碘化丙啶后,細(xì)胞膜長(zhǎng)久性或可逆性損傷的細(xì)胞將發(fā)出紅色熒光。通過這種方式,碘化丙啶能夠快速且可靠地識(shí)別和定量死亡和壞死細(xì)胞。碘化丙啶有助于確定整體細(xì)胞活性,這是用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞群體對(duì)細(xì)胞毒性**或其他環(huán)境因素的反應(yīng)的重要參數(shù)。

 

活力研究通常包括使用碘化丙啶染色,搭配細(xì)胞凋亡標(biāo)記染料(如Annexin V-FITC或發(fā)出明亮綠色熒光的iFluor® 488)。當(dāng)一起使用時(shí),可以獲得總細(xì)胞計(jì)數(shù),并且可以觀察樣本中的細(xì)胞形態(tài)。例如,使用這兩種染色劑可以區(qū)分完整細(xì)胞(iFluor® 488-PI-)、早期凋亡細(xì)胞(iFluor® 488+PI-)和晚期凋亡或壞死細(xì)胞(iFluor® 488+PI+)。

 


碘化丙啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)

 

 

PI染色方案

PI染色細(xì)胞的基本方法如下:

 

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備:將PI(碘化丙啶)溶解在PBSTris-EDTA緩沖液等緩沖溶液中。染色溶液中PI的濃度可能因?qū)嶒?yàn)條件而異,但通常為1-5mg/ml。

2. 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞從生長(zhǎng)表面(例如培養(yǎng)皿)分離,粘附細(xì)胞使用胰蛋白酶處理,懸浮細(xì)胞使用離心。將多達(dá)1X10^6個(gè)細(xì)胞/100微升分裝到聚苯乙烯管中,并在輕輕渦旋的同時(shí)加入70%的乙醇。

3. 細(xì)胞清洗:向細(xì)胞添加2毫升PBS,以300 X g離心5分鐘,然后將緩沖液從沉積的細(xì)胞中倒出。重復(fù)此步驟共2次,以除去殘留的培養(yǎng)基或血清成分。

4. 細(xì)胞重懸:含有PI的染色溶液(例如,PBS0.1%BSARNase、PI儲(chǔ)備液)應(yīng)加入到細(xì)胞懸液中,以達(dá)到所需的PI濃度。輕輕混合細(xì)胞和PI溶液以確保均勻染色。

5. 細(xì)胞孵育:根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,在37攝氏度下孵育細(xì)胞一段時(shí)間。通常在暗室中用PI孵育細(xì)胞超過30分鐘,以防止光照導(dǎo)致降解。

6. 分析細(xì)胞:孵育后,用PI染色的細(xì)胞可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析,激光發(fā)出的光波長(zhǎng)為488nm(藍(lán)綠色)來激發(fā)細(xì)胞。發(fā)出的熒光為紅色,波長(zhǎng)為617nm。在**組織化學(xué)(IHC)中,PI常用作核染色劑,用于在組織切片中染色細(xì)胞核。

 

該方案應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和優(yōu)化進(jìn)行調(diào)整。

 

碘化丙啶的優(yōu)點(diǎn)及常見問題

 

使用碘化丙啶染色技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是這些方法幾乎不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損耗,并且可以避免通過水解引起的細(xì)胞損傷。然而,使用碘化丙啶也存在一些常見的問題。傳統(tǒng)的Annexin V/PI方案以及類似的染色方案可能導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量的假陽性事件(>40%)。這種假陽性與碘化丙啶也會(huì)染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的RNA有關(guān)。這個(gè)問題可能出現(xiàn)在初代細(xì)胞和細(xì)胞系中,*常見于核質(zhì)比較小的較大細(xì)胞。

 

由于碘化丙啶是一種不可穿透細(xì)胞膜的DNA染料,它通常與一種可穿透細(xì)胞膜的DNA染料一起用于**活性研究中。然而,在研究中,碘化丙啶對(duì)生物膜中貼壁細(xì)胞的染色已表現(xiàn)出明顯低于實(shí)際**活性的情況,這是由于細(xì)胞外核酸(eNA)的存在。觀察時(shí),似乎會(huì)出現(xiàn)一層假死的紅色碘化丙啶染色細(xì)胞。這種情況有時(shí)會(huì)掩蓋一部分雙重染色的細(xì)胞,這些細(xì)胞內(nèi)部是綠色的,表明其活性,而紅色層則表明DNA可能位于整個(gè)細(xì)胞膜之外。

 

 

因此,這類細(xì)胞群體的活力染色結(jié)果使用另一種估計(jì)活力的方法進(jìn)行驗(yàn)證,例如,共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)或熒光顯微鏡。在大多數(shù)情況下,碘化丙啶的使用限于固定或滲透的細(xì)胞,如果遇到活細(xì)胞則會(huì)被活細(xì)胞主動(dòng)排出的細(xì)胞中。在滲透和固定過程中,通常選擇使用醇類或醛類試劑。重要的是,醛和醇通常與熒光蛋白和某些表面標(biāo)記不兼容,因此對(duì)苯甲醛可能是更合適的選擇。就**性而言,碘化丙啶是一種疑似致癌物質(zhì),可能引起皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)刺激。


研究了流體剪切力(FSS)對(duì)腎小管細(xì)胞中凋亡和壞死的影響。HK-2細(xì)胞的密集單層在靜態(tài)條件(FSS 0)或0.5 Pa流體剪切應(yīng)力(FSS 0.5)下培養(yǎng)48小時(shí)。A/細(xì)胞先用Annexin-V染色,然后立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析磷脂酰絲氨酸的外翻(Annexin-V熒光,X軸)和碘化丙啶(PI)的攝取(PI熒光,Y軸)。通過Annexin-V-/PI-(左下象限)、Annexin-V+/PI-(右下象限)和Annexin-V+/PI+(右上象限)的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞(初級(jí)或次級(jí))。B/早期凋亡和壞死細(xì)胞的比例進(jìn)行了量化,結(jié)果以細(xì)胞總?cè)后w的百分比表示。數(shù)據(jù)表示7次實(shí)驗(yàn)的平均值 ± SEM。*HK-2細(xì)胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根據(jù)制造商的指示評(píng)估凋亡和壞死。

 

產(chǎn)

1.Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒選擇指南

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

Ex/Em

規(guī)格

Cell Meter PE-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 適用于流式細(xì)胞儀

22838

565/575nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒橙色熒光 405nm激發(fā)

22830

527/550nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 綠色熒光 405nm激發(fā)

22829

410/501nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 藍(lán)色熒光 405nm激發(fā)

22828

406/445nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 深紅色熒光 適合流式細(xì)胞檢測(cè)

22827

656/670nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 紅色熒光 適合流式細(xì)胞檢測(cè)

22826

587/603nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 橙色熒光 適合流式細(xì)胞檢測(cè)

22825

557/570nm

100 Tests

Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒 綠色熒光 適合流式細(xì)胞檢測(cè)

22824

491/516nm

100 Tests

Cell Meter FITC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 適合于流式細(xì)胞儀

22839

491/516nm

100 Tests

Cell Meter APC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 適合于流式細(xì)胞儀

22837

651/660nm

100 Tests

 

 表2.在死細(xì)胞和固定細(xì)胞中,用核酸染色標(biāo)記細(xì)胞核

 

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

Ex/Em

規(guī)格

核藍(lán)DCS1死細(xì)胞染料

17548

348/469nm

0.5mL

死細(xì)胞核染料DiTO-15mM DMSO溶液 相當(dāng)于TOTO-1

17575

514/531nm

0.2ml

核綠DCS1死細(xì)胞染料

17550

503/527nm

0.5mL

核綠DCS1光固定型死細(xì)胞核染料

17570

502/527nm

1mg

死細(xì)胞核染料TWO-PRO1相當(dāng)于TO-PRO1

17571

515/531nm

0.2mL

核橙DCS1死細(xì)胞染料

17551

514/556nm

0.5mL

碘化丙錠PI

17516

537/618nm

5g

碘化丙錠PI*10mM水溶液*

17517

537/618nm

1mL

死細(xì)胞核染料DiYO-1 相當(dāng)于YOYO1*5 mM DMSO Solution

17580

491/508

0.2mL

 

3.Live or Dead細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

Ex/Em

規(guī)格

 

Live or Dead細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 綠色/紅色雙熒光

22789

494/514

537/618

200Tests

 

Live or Dead細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 綠色/紅色雙熒光

22760

494/514

537/618

1000Tests

 

Live or Dead細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 紅/藍(lán)雙色熒光

22788

613/631

348/469

200Tests

 

 

4.

MycoLight熒光活/死**成像試劑盒

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

Ex/Em

Em顏色

規(guī)格

MycoLight熒光活/死**成像試劑盒

22411

488/530

537/618

綠(活)

紅(死)

100Tests

 


 

 

 

 

 

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