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技術(shù)文章

百螢課堂關(guān)于Annexin V的那些疑惑

1.百螢---Annexin V簡介

Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,它通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。

 

2.百螢---Annexin V適用儀器

Annexin V凋亡檢測試劑盒適用儀器:流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡

 

3.百螢---Annexin V常見問題以及解答

Q:  什么是Annexin V/PI測定?

A:  Annexin V/PI測定用于通過annexin V標(biāo)記區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和通過丙碘胺(PI)標(biāo)記區(qū)分壞死/死亡細(xì)胞。在早期凋亡階段,細(xì)胞膜開始失去不對稱性,導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位到膜的外表面,在此處annexin V共軛物可以檢測到它。然而,在細(xì)胞膜破裂的情況下,例如壞死,annexin V共軛物可以進入并結(jié)合內(nèi)層膜中的PS殘基,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此,建議使用不透過細(xì)胞膜的核染料(如PI)與annexin V共軛物一起使用。這使用戶可以區(qū)分早期凋亡細(xì)胞(annexin V染色)、晚期凋亡細(xì)胞(annexin VPI染色)和壞死細(xì)胞(僅PI染色)。

 

Q:  Annexin V是什么顏色的?

A:  就其本身而言,Annexin V 是無色的且難以檢測。 為了檢測Annexin V 與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合,Annexin V 通常與異硫氰酸熒光素 (FITC) 結(jié)合,FITC 是一種綠色熒光化合物,激發(fā)峰為 491 nm,發(fā)射峰為 516 nm。 用 FITC 或任何其他綠色熒光染料標(biāo)記Annexin V,例如 iFluor 488Ex/Em = 491/516 nm)。

 

Q:  Annexin VTUNEL有什么區(qū)別?    

A:  末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 是一種染色方法,用于識別細(xì)胞內(nèi) DNA 片段化位點——晚期細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性特征。 它使用酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 將修飾的 dNTP(例如 dUTP)連接到片段化 DNA 鏈的 3'-羥基末端。 dNTPs 通常用熒光團修飾以促進量化和/或可視化。

Annexin V 染色通過結(jié)合由于細(xì)胞膜不對稱性喪失而暴露在細(xì)胞外的 PS 殘基來識別細(xì)胞凋亡的早期階段。 Annexin V 通常用 FITC 等熒光團標(biāo)記,以促進凋亡細(xì)胞的檢測。

 

Q:  Annexin V陽性是什么意思?

A:  Annexin V陽性結(jié)果表明細(xì)胞處于凋亡的早期狀態(tài),該術(shù)語通常用于Annexin V/PI檢測,通過根據(jù)細(xì)胞群的健康狀況來區(qū)分細(xì)胞群。詳情如下:

1.Annexin V 陰性/PI陰性:說明細(xì)胞很健康

2.Annexin V 陽性/PI陽性:說明該細(xì)胞處于壞死或凋亡晚期。

 

Q:  什么是Annexin V的陽性對照?

A:  Annexin V陽性對照是使用已知的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞。 當(dāng)用Annexin V 偶聯(lián)物(例如膜聯(lián)蛋白 V-FITC)染色時,這些細(xì)胞會產(chǎn)生陽性信號。 例如,細(xì)胞凋亡可通過在 55°C 下加熱細(xì)胞 20 分鐘或處理已知可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞試劑(如喜樹堿或星形孢菌素)來誘導(dǎo)。

 

Q:  什么是Annexin V結(jié)合緩沖液?

A:  在實驗樣品中,Annexin V結(jié)合緩沖液能夠促進Annexin V與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。這些結(jié)合緩沖液需要含有足夠高濃度的鈣,使Annexin VPS結(jié)合,但不能高到與其他磷脂結(jié)合。Annexin V結(jié)合緩沖液也可用于洗滌樣品,使其不含過量的膜聯(lián)蛋白和其他化學(xué)殘留物質(zhì),以確保檢測。染色前,應(yīng)將細(xì)胞重懸于濃度為1x10^6/mlAnnexin V結(jié)合緩沖液中。

 

Q:  Annexin V是怎樣工作的?

A:  Annexin V 通過結(jié)合暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 殘基來識別正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞。 在活的健康細(xì)胞中,PS 殘基位于質(zhì)膜的內(nèi)層,在那里它們無法與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 當(dāng)細(xì)胞啟動程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)時,它們的質(zhì)膜會失去不對稱性。 PS 殘基從膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部小葉,在那里它們可以與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 Annexin V 通常與熒光團(如 FITC)結(jié)合,以促進凋亡細(xì)胞的檢測。

 

Q:  Annexin V染色后,能否進行細(xì)胞固定

A:  可以,細(xì)胞可以在Annexin V染色后進行固定操作。如果需要固定細(xì)胞,請滿足以下三個條件:1.使用不含酒精的醛類固定。2.請使用含有CaCl2的緩沖液。3.避免使用洗滌劑或表面活性劑。注意事項:在Annexin V染色前,千萬不要固定細(xì)胞,固定細(xì)胞會殺死細(xì)胞,而Annexin V染色只能在活細(xì)胞或組織上進行。

 

Q:  Annexin V能染色壞死細(xì)胞嗎?

A:  是的,Annexin V可以染色壞死細(xì)胞。壞死是指不正常的細(xì)胞死亡,可能由各種事件觸發(fā),包括組織缺血和缺氧或細(xì)胞區(qū)域的急性損傷。壞死細(xì)胞的一個關(guān)鍵特征是質(zhì)膜破裂。這個事件使得Annexin V可以進入整個質(zhì)膜,包括PS殘基存在的內(nèi)葉片,導(dǎo)致假陽性。因此,建議使用細(xì)胞不滲透染料(例如丙碘錠或7-AAD)與Annexin V結(jié)合物相結(jié)合,以消除假陽性并區(qū)分凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。圖中使用Annexin V將凋亡細(xì)胞染成綠色,使用7-AAD將壞死細(xì)胞染成紅色。

 

Q:  染色完不能及時上機,樣本能固定嗎?

A:  細(xì)胞染色完成后,禁止固定,應(yīng)盡快檢測,若無法立即檢測,可將樣本管放冰上,減少外界環(huán)境對檢測結(jié)果的影響,Annexin V 結(jié)合不穩(wěn)定,請務(wù)必在標(biāo)記結(jié)束后半小時內(nèi)檢測。

 

Q:  如何統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)?

A:  Annexin V 凋亡實驗在做凋亡統(tǒng)計時一般統(tǒng)計細(xì)胞早期凋亡率,也有文獻統(tǒng)計總的凋亡比例(早期凋亡和晚期凋亡或壞死細(xì)胞之和)。

Q:血液樣本是否可以用于凋亡檢測?

A:如果樣品來源于血液,請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有 PS,能與 Annexin-V 結(jié)合,從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。

Q:有沒有更好的辦法處理貼壁細(xì)胞,來做流式凋亡實驗?

A:檢測貼壁細(xì)胞時,若消化時間不易控制,建議用 Accutase 細(xì)胞消化液,對細(xì)胞損傷小且不會改變細(xì)胞膜上 PS 的分布。

Q:  細(xì)胞凋亡早期,可以用Annexin V-FITC/PI雙染色法區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞嗎?

A:  在正常的活細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),細(xì)胞發(fā)生凋亡時,細(xì)胞膜發(fā)生變化,PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin-V(膜聯(lián)蛋白-V)是一種分子量為35-36 KDCa2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力結(jié)合。用熒光素(FITC、Alexa Fluor488等)標(biāo)記的Annexin-V作為探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡即可鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。

壞死的細(xì)胞PS同樣也會從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面,Annexin-V也能識別壞死細(xì)胞表面的PS,所以Annexin-V無法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,能夠與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合,而且它不能透過完整的細(xì)胞膜。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整,PI染料無法自由通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合,所以PI染料無法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞,而PI染料卻能夠通過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合,壞死細(xì)胞內(nèi)的PI染料被488nm激光激發(fā)后會發(fā)射紅熒光,被相應(yīng)通道接收。所以Annexin VPI同時使用,就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

 

圖為Annexin-V/PI雙染色后流式檢測結(jié)果分析

 

以上就是百螢對Annexin V凋亡檢測常見問題的整理,歡迎大家一起討論。

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