注: PE 和 APC 的完整操作步驟及標(biāo)記方案在后兩頁,如果不需要看介紹,可直接跳過
藻 紅 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)
特 點(diǎn) :
1.從紅藻中純化
2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合,不被淬滅
4.高水溶性
R-PE 與 B-PE 的 區(qū) 別 :
Wavelength (nm)
Wavelerngn (mm)
R-PE 與 B-PE 的 對(duì) 比 :
|
R-PE
|
B-PE
|
分子量
|
240,000
|
240,000
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*大吸收
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565 nm
|
545 nm
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額外的吸收峰
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498 nm
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564nm
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*大發(fā)射
|
573 nm
|
573 nm
|
消光系數(shù)(ε)
|
1.96x106 M-1cm-1
|
2.41x106 M-1cm-1
|
熒光量子產(chǎn)率(QY)
|
0.84
|
0.98
|
吸收比
|
A566/A280≥5.0
A566/A498<1.5
A620/A566<0.01
|
A545/A280≥5.5
A565/A496<2.7
A620/A545<0.01
|
特 點(diǎn) :
1.從藍(lán)藻中純化
2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合,不被淬滅
4.高水溶性
APC 和 C-PC 的區(qū)別:
APC 和 C-PC 的對(duì)比:
|
APC
|
C-PC
|
分子量
|
104,000
|
264,000
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*大吸收
|
651nm
|
651nm
|
*大發(fā)射
|
662nm
|
647 nm
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消光系數(shù)(?)
|
7.3x105 M-1cm-1
|
1.53x106cm-1M-1
|
熒光量子產(chǎn)率(QY)
|
0.68
|
0.81
|
吸收比
|
A650/A620≥1.25
A650/A280≥4.5
|
A652/A620<0.3
A620/A280>4
|
交 聯(lián) APC 和 APC 的 對(duì) 比 :
1.APC 結(jié)構(gòu): 它具有α和β亞基,具有明顯的(αβ)3 四級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.為什么要將APC 進(jìn) 行 交 聯(lián) ?
答 :交聯(lián)是為了防止APC 在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍) 時(shí)
發(fā)生可逆解離,從而保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。
3. 如何進(jìn)行 APC 交聯(lián)?
答:通過α和β亞基間的特異性 j聯(lián)可以阻止APC 的分解。
交聯(lián)比:>1.0
|
NaClO4
|
A650:A620
|
CL-APC
|
|
1.465849387
|
CL-APC+NaClO4
|
+
|
1.386850153/
|
|
NaClO4
|
A650:A620
|
APC
|
|
1.587272727
|
APC+NaClO4
|
+
|
0.317901235
|
注:圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4, 藍(lán)色線條為添加了NaClO4。
如圖及表中信息所示, CL-APC 圖中添加NaClO4 及沒添加NaClO4, 吸收比沒有明顯變化。而在未交聯(lián)的APC
中, 添加NaClO4, 得到的吸收比有非常大的變化, 因?yàn)锳PC中加入了NaClO4 導(dǎo)致了它出現(xiàn)了解離。
特 點(diǎn) :
1.存在于大多數(shù)光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光 譜 特 性 :
|
PerCP
|
分子量
|
35,000
|
*大吸收
|
483nm
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*大發(fā)射
|
676nm
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消光系數(shù)(ε)
|
4.0x105 M-1cm-1
|
熒光量子產(chǎn)率(QY)
|
1.0
|
亮度(exQY)
|
4.9x105M-1cm-1
|
吸收比
|
A482/A280>4.0
|
一 .P E 的 制 備
1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意: PE 在綴合前作為 SAS ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉
淀物*穩(wěn)定。如果將 PE 以 SAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。
2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3. 檢查 PE 的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280、565 和 6 2 0 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 PE 在 565nm 處的 OD 為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白;565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。
二 .P E 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。
3.將純化的 PE 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少 SMCC 相對(duì)于 PE 的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液:每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘,無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含
有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起??梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。
四 .進(jìn) 行 綴 合
1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這些
摩 爾 比 ( 每 IgG 約 2 個(gè) PE) 效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所幫 助。
2.60 分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
2.60 分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
注1:整個(gè)綴合過程可以在 **內(nèi)完成。但是,綴合前對(duì)APC 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面
列出的材料外,您還需要濃度至少為 2 mg/ml 的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行APC 抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉
如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注 2 : SMCC-APC 綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液”中,在4C 下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此, 如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間,可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 APC, 并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(
在幾周內(nèi))。 SMCC-APC 的長期儲(chǔ)存*好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一 .A PC 的 制 備
1.將 APC 純化。綴合前的濃度通常為 5-10 mg/ml 。 注意: APC 在綴合前作為 SAS (硫酸銨鈉)
沉淀物*穩(wěn)定。如果將 APC 以 SAS 沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫 升 1 升的“透析緩沖液”透析之前,用每毫升1 升 APC 的 PBS 進(jìn)行透析2 次。
2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查 APC 的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280、620和655 nm 處的吸光度。 (1 mg/ml 的 APC 在 655nm 處的 OD 為 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4 表明雜質(zhì)被充分去除; 655/280 比 率 > 4 表 明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除
二 .A PC 的 活 化
1.使用前在無水 DMSO 中制備 10 mg/ml 的 SMCC 儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克 APC 加 入 6 μlSMCC, 并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。
3.將純化的 APC 過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少 SMCC 相對(duì)于 APC 的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三 . 1gG 還 原
1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鮮溶液。
2.1gG 溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml 或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、 磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml, 則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液:每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30
分鐘,無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。
4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含
有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起??梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT 濃度可能會(huì)有所幫助。
四 .進(jìn) 行 綴 合
1.每毫克IgG 添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這 些 摩 爾 比 ( 每 1gG 約 2 個(gè) APC) 效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所 幫助。
2.60 分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。
1.
2.60 分鐘后,必須去掉 lgG 上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg NEM 的新鮮溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。