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技術(shù)文章

藻膽蛋白的自我介紹之藻紅蛋白篇

注: PE 和 APC 的完整操作步驟及標(biāo)記方案在后兩頁,如果不需要看介紹,可直接跳過

 

(R-PE 及 B-PE)

點(diǎn)

1.從紅藻中純化

2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率

3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合,不被淬滅

4.高水溶性


R-PE    與 B-PE    的 區(qū) 別 :

Wavelength (nm)


 

 


Wavelerngn (mm)


 

 

R-PE   與 B-PE    的 對(duì) 比 :

 

 

R-PE

B-PE

分子量

240,000

240,000

*大吸收

565 nm

545 nm

額外的吸收峰

498 nm

564nm

*大發(fā)射

573 nm

573 nm

消光系數(shù)(ε)

1.96x106 M-1cm-1

2.41x106 M-1cm-1

熒光量子產(chǎn)率(QY)

0.84

0.98

 

 

吸收比

 

A566/A280≥5.0

A566/A498<1.5

A620/A566<0.01

 

A545/A280≥5.5

A565/A496<2.7

A620/A545<0.01

 

 


點(diǎn)

1.從藍(lán)藻中純化

2.具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率

3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合,不被淬滅

4.高水溶性

APC 和 C-PC  的區(qū)別:


 

APC 和 C-PC 的對(duì)比:

 

 

APC

C-PC

分子量

104,000

264,000

*大吸收

651nm

651nm

*大發(fā)射

662nm

647 nm

消光系數(shù)(?)

7.3x105 M-1cm-1

1.53x106cm-1M-1

熒光量子產(chǎn)率(QY)

0.68

0.81

吸收比

A650/A620≥1.25

A650/A280≥4.5

A652/A620<0.3

A620/A280>4

 

聯(lián) APC    和 APC     的 對(duì) 比 :

1.APC    結(jié)構(gòu): 它具有α和β亞基,具有明顯的(αβ)3 四級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.為什么要將APC 進(jìn) 行 交 聯(lián) ? 

答 :交聯(lián)是為了防止APC 在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍) 時(shí)

發(fā)生可逆解離,從而保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。

3. 如何進(jìn)行 APC 交聯(lián)?

答:通過α和β亞基間的特異性  j聯(lián)可以阻止APC 的分解。

 
交聯(lián)比:>1.0


 

 

NaClO4

A650:A620

CL-APC

 

1.465849387

CL-APC+NaClO4

+

1.386850153/

 

 

NaClO4

A650:A620

APC

 

1.587272727

APC+NaClO4

+

0.317901235

注:圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4,   藍(lán)色線條為添加了NaClO4。

如圖及表中信息所示, CL-APC  圖中添加NaClO4  及沒添加NaClO4,   吸收比沒有明顯變化。而在未交聯(lián)的APC

中, 添加NaClO4,    得到的吸收比有非常大的變化, 因?yàn)锳PC中加入了NaClO4  導(dǎo)致了它出現(xiàn)了解離。


2.

特 點(diǎn) :

1.存在于大多數(shù)光合作用的甲藻中

2.高水溶性

3.大斯托克斯位移

 

 

 

PerCP

分子量

35,000

*大吸收

483nm

*大發(fā)射

676nm

消光系數(shù)(ε)

4.0x105 M-1cm-1

熒光量子產(chǎn)率(QY)

1.0

亮度(exQY)

4.9x105M-1cm-1

吸收比

A482/A280>4.0

 

 




 .P E 的 制 備

1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意: PE  在綴合前作為 SAS  ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉

淀物*穩(wěn)定。如果將 PE   以 SAS   沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。

2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG,    包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3. 檢查 PE  的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280、565 和 6 2 0 nm   處的吸光度。  (1  mg/ml      的 PE  在 565nm   處的 OD  為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白;565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。

 

.P E 的 活 化

1.使用前在無水 DMSO   中制備 10  mg/ml     的 SMCC  儲(chǔ)備溶液。

2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC,    并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。

3.將純化的 PE  過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少 SMCC   相對(duì)于 PE   的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

 

. 1gG    還 原

1.在蒸餾水中制備 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml   或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、 磷酸鹽和 TRIS    緩沖液 (pH     范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2  mg/ml,   則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液:每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并攪拌。室溫下靜置30

分鐘,無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含

有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起??梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT   濃度可能會(huì)有所幫助。

 

.進(jìn) 行 綴 合

1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。    用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這些

( 每 IgG   約 2 個(gè) PE)   效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所幫 助。

2.60 分鐘后,必須去掉 lgG   上未反應(yīng)的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 


 

1.


2.60 分鐘后,必須去掉 lgG   上未反應(yīng)的游離巰基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制備 10  mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 

 

 

1:整個(gè)綴合過程可以在 **內(nèi)完成。但是,綴合前對(duì)APC 的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面

列出的材料外,您還需要濃度至少為 2 mg/ml   的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行APC 抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉

如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

2 : SMCC-APC    綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液”中,在4C 下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此,  如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間,可以選擇同時(shí)綴合10 毫克或更多的 APC,  并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(

在幾周內(nèi))。 SMCC-APC     的長期儲(chǔ)存*好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

 

 .A  PC 的 制 備

1.將 APC  純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意: APC  在綴合前作為 SAS  (硫酸銨鈉)

沉淀物*穩(wěn)定。如果將 APC   以 SAS   沉淀物的形式儲(chǔ)存,則必須在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫 升 1 升的“透析緩沖液”透析之前,用每毫升1 升 APC   的 PBS   進(jìn)行透析2 次。

2.使用1 .7毫克APC 修飾每毫克lgG,    包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3.檢查 APC  的純度和濃度,請(qǐng)測(cè)量280、620和655 nm   處的吸光度。   (1 mg/ml    的 APC  在 655nm   處的 OD  為 5 . 9 ) 。 655/620   比 率 > 1 . 4 表明雜質(zhì)被充分去除;  655/280    比 率 > 4 表 明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除

 .A   PC 的 活 化

1.使用前在無水 DMSO   中制備 10  mg/ml     的 SMCC  儲(chǔ)備溶液。

2.每毫克 APC  加 入 6 μlSMCC,    并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好,室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。

3.將純化的 APC  過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意:對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合,增加或減少 SMCC   相對(duì)于 APC   的量,可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

 

. 1gG    還 原

1.在蒸餾水中制備 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應(yīng)為 4 mg/ml   或更高,這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行; MES 、 磷酸鹽和 TRIS    緩沖液 (pH     范圍為 6 至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于 2  mg/ml,   則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液:每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并攪拌。室溫下靜置30

分鐘,無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過預(yù)平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分,測(cè)定蛋白濃度,并將含

有大部分lgG 的級(jí)分匯集在一起??梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。

注意:對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況,降低 DTT  濃度可能會(huì)有所幫助。

 

.進(jìn) 行 綴 合

1.每毫克IgG     添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60 分鐘。注意:這 些 摩 爾 比 ( 每 1gG  約 2 個(gè) APC)  效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合,不同的摩爾比可能會(huì)有所 幫助。

2.60 分鐘后,必須去掉 lgG   上未反應(yīng)的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 1.


2.60 分鐘后,必須去掉 lgG   上未反應(yīng)的游離巰基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制備 10  mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20 分鐘。

 

 

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